超临界CO₂萃取的优化方法提取斜叶微藻中的类胡萝卜素和脂溶性维生素

  为丰富公司员工的知识体系，开拓视野，本司定期开展文献汇报的交流培训会，以提高员工的知识水平和能力。第二期《亚洲必赢国际437app文献汇报》于2022年9月9日上午在亚洲必赢国际437app研发中心会议室如期举行。外贸部伍婉君分享了一篇来自罗马大学化学系Cleofe Palocci研究团队于2019年发表在《Molecules》的文章，文章名为“Extraction of Carotenoids and Fat-Soluble Vitamins from Tetradesmus Obliquus Microalgae: An Optimized Approach by Using Supercritical CO₂”。本次文献汇报除技术部与品控部同事到场参加外，还以腾讯会议的线上方式让公司所有部门的同事都可在线参加，供大家讨论与学习。

  此文章主要研究了超临界流体萃取法（Supercritical Fluid Extraction, SFE）中压力、温度和极性助溶剂等参数对提取斜叶微藻中类胡萝卜素和脂溶性维生素产量的影响。通过采用超临界流体萃取法中最常用的超临界CO₂萃取法（Supercritical CO₂ (SCCO₂) Extraction），分别把实验条件控制在压力范围为25～35 MPa，温度范围为40～60℃，并对应添加5%甲醇（MeOH）或柠檬烯（Limonene）作为助溶剂，设置13个实验组。此外，还设置了基质固相分散萃取法（Matrix Solid-Phase Dispersion , MSPD）实验组作为对比实验。把各实验组萃取所得的提取物用液相色谱-质谱联用仪（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer, LC-MS）进行分析，分别得到α -生育酚、叶绿醌、γ-生育酚、视黄醇、角黄素、番茄红素和叶黄素的提取率(平均峰面积±标准误差)。结果发现，对于低极性或中极性类胡萝卜素和维生素而言，通过调节SFE的压力、温度和极性助溶剂等变量条件，可获得与MSPD相当或更高的的提取率。尤其在SFE中使用柠檬烯作为助溶剂，番茄红素可获得更高的萃取率。但对角黄素和叶黄素这类强极性化合物而言，使用MSPD获得的提取率则显著高于SFE。  

  在伍婉君精彩汇报后，现场评委对其进行了点评，参会人员均积极参与讨论，并提出自己的疑问。此问答环节让大家对此文章的内容有了更深刻的理解。

答疑解惑 Q&A

1、什么是超临界流体？超临界流体是一种什么样的状态？

  答：对于分子量不太大的稳定物质会存在一个临界点，其由临界温度、临界压力和临界密度构成，当把处于气液平衡的物质升温升压时，热膨胀引起液体密度减少，压力升高使气液两相的界面消失，成为均相体系，即为临界点。高于临界温度和临界压力的流体是超临界流体，即处于气液不分的状态。超临界流体对温度和压力的改变十分敏感，具有十分独特的物理性质，其黏度低、密度大，良好的流动、传质、传热和溶解性能，很适合用于提取物质。

2、超临界CO₂萃取法的原理是什么？

  答：其原理是CO₂在超临界状态下与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。并通过控制压力、温度、助溶剂等条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，使被萃取物质完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的。

3、为什么此实验会采用CO₂作为超临界流体萃取的萃取剂，而不用其他物质呢？

  答：因为（1）CO₂具有、安全、无毒、成本低、易获取的特点；（2）CO₂临界值低，临界条件容易达到；（3）CO₂化学性质不活泼，不易与其他物质发生反应。因此CO₂是目前较常用的超临界流体。

4、甲醇与柠檬烯都是助溶剂，它们之间有什么区别吗？

  答：甲醇和柠檬酸都是助溶剂，加入助溶剂能改变超临界流体对溶质的溶解能力，但不同的是对于不同化学结构的物质，助溶剂对其溶解性能有不同的效果。如，番茄红素是一种结构与柠檬烯非常相似的物质，加入柠檬醛能使超临界CO₂更好的溶解番茄红素，从而也能提高超临界流体对番茄红素的提取率；而加入甲醇能有效提高超临界流体对脂溶性维生素的溶解性。

5、超临界流体萃取（SFE）具有什么优势呢？

  答：首先，超临界流体基于他独特的物理性质，具有良好的溶解性，很适合用于提取物质。其次，超临界流体处于超临界状态，对温度和压力的改变十分敏感，我们可以通过改变温度和压力等控制条件，获得较高的提取率。

6、什么是基质固相分散萃取（MSPD）？

  答：基质固相分散萃取是美国Barker教授在1989年提出并给予理论解释的一种快速样品处理技术。其原理是将涂渍C18等多种聚合物的材料与样品一起研磨，得到半干状态的混合物，并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂梯度冲洗柱子，将各种待测物洗脱下来，以达到分离提取的效果。

7、基质分散固相萃取法（MSPD）中提及样品需要与C18一起研磨，C18在这里是起到什么作用呢？

  答：C18具有疏水性和吸附作用，被C18吸附的物质可通过不同的溶剂把待测物洗脱下来，从而达到快速分离的目的。

8、实验结果中，对于角黄素和叶黄素，为什么MSPD的提取率显著高于SFE？

  答：角黄素和叶黄素从分子结构上看，都具有含有两个羰基，属于极性很强的化合物，这种强极性化学结构使它们即使在高密度和助溶剂甲醇存在的情况下，也很难溶于超临界CO₂，因此MSPD的提取率显著高于SFE。

9、番茄红素的提取结果中，以柠檬醛为助溶剂得到的提取率为什么会高于以甲醇为助溶剂得到的提取率？

  答：番茄红素是一种结构上与柠檬烯非常相似的非极性化合物，因此在柠檬醛作为助溶剂的条件下，能更好地提取样品中番茄红素。

10、此文章中所提及的实验的重复性和重现性如何？

  答：文章中的试验结果部分描述较简短，所以并未明确地提及该实验是否设置重复实验。但实验结果中各物质的提取率是用平均峰面积±标准误差来表示的。说明这个实验的结果是通过多结果的平均值得来的。估计有两种可能：一种是在各条件下进行多组平行实验得到的提取物，分别进行LC-MS分析，得到多个的峰面积。此操作方式更能真正体现实验结果的重复性，但会导致组内数据偏差较大。另一种就是在各条件下得到的提取物，进行多次LC-MS分析，获得多个峰面积。此操作方式体现的是LC-MS分析结果的重复性，对超临界流体萃取（SFE）或基质分散固相萃取法（MSPD）提取物质这一结果的重复性没有指导意义。

11、通过这篇文献，你学到了什么？对你未来的工作有什么指导意见？

  答：通过此次文献汇报学习，了解到SFE优化后的萃取条件，与传统的固液萃取相比，能有效提高某些化合物的提取率。但该文章中，以柠檬烯为助溶剂的实验组仅设置了一个萃取条件（温度40℃，气压为25Mpa），未能体现以柠檬烯为助溶剂时，不同萃取条件下对各物质提取量的影响。如在实验中增加柠檬烯助溶剂的萃取条件梯度（如，温度分别设置为40℃、50℃和60℃，气压分别设置为25Mpa、30 Mpa和35 Mpa），能更好地对比不同萃取条件下，甲醇和柠檬烯这两种助溶剂对各物质提取量的影响，使实验结果更完整。同时，对低极性或中极性类胡萝卜素和维生素而言，可通过调节SFE的极性条件，获得与MSPD相当或更高的的提取率。但对角黄素和叶黄素这类强极性化合物而言，使用MSPD获得的提取率则显著高于SFE。这对日后提取物质提供了较好的思路，我们可以借鉴这两种萃取方法的原理，根据所需提取物质极性大小的不同而选择相对更优的提取方法。

文献引用：

Laura Chronopoulou, Chiara Dal Bosco, Fabrizio Di Caprio, Letizia Prosini, Alessandra Gentili, Francesca Pagnanelli, Cleofe Palocci. Extraction of Carotenoids and Fat-Soluble Vitamins from Tetradesmus Obliquus Microalgae: An Optimized Approach by Using Supercritical CO₂ [J]. Molecules, 2019, 24 ( 14 ) .

原文链接：

https://sci-hub.se/10.3390/molecules24142581